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PrimerCalc 引物 Tm 计算

近邻法 Tm · 盐/浓度校正 · 发夹与二聚体自查

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输入引物序列

每行一条引物；支持「名称 序列」与 FASTA（> 头行）；大小写不敏感，U 按 T 处理，空格与行号自动忽略。

反应条件

Tm 按近邻法 ΔS 盐校正（0.368·N·ln[Na⁺]）与浓度项 R·ln(Ct/4) 计算；普通 PCR 缓冲液 Na⁺ 约 50 mM，qPCR 引物浓度常取 200–500 nM。

Tm 与结构总览

参数明细

SantaLucia 1998 最近邻参数表

栈参数取自 SantaLucia, J. (1998) PNAS 95:1460-1465 表 2（统一参数）；起始修正 A•T 末端 +2.3 kcal/mol / +4.1 cal/(mol·K)、G•C 末端 +0.1 / 0，非自互补双链另加对称性修正 −1.4 cal/(mol·K)。Tm = ΔH×1000 ÷ (ΔS′ + R·ln(Ct/x)) − 273.15，普通双链取 Ct=2C、x=4，自互补取 Ct=C、x=1；ΔS′ = ΔS + 0.368·N·ln[Na⁺]。

这是什么工具

PrimerCalc 是 PCR 引物/寡核苷酸的在线 Tm 计算器：主结果用最近邻热力学法（SantaLucia 1998 统一参数表），把每个二核苷酸栈的焓与熵逐段相加，再叠加末端起始修正、对称性修正、盐浓度熵校正和浓度项 R·ln(Ct/x)，得到解链温度 Tm；同时给出 GC%、GC 钳、Wallace/简易经验式对照，以及 3' 端自互补、发夹、同聚物等结构自查与设计规则警告。功能对标 Thermo Fisher OligoAnalyzer 与 IDT OligoCalc 的核心指标，且支持一次粘贴多条序列批量算。

所有计算都在你自己的浏览器里完成：参数表随页面下载，没有后端、不上传任何序列。当前输入存在浏览器本地，刷新还在；几百条引物也是毫秒级算完。引物二聚体与发夹的 ΔG 用栈和近似（不含起始项），与 MARMIA 的局部稳定性指标同一口径，适合横向比较不同候选引物。

功能

怎么用

  1. 把候选引物粘贴进输入框：每行一条；想标名字就写「F1 ATGG…」或用 FASTA 头行。
  2. 按你的体系调「引物浓度」和「Na⁺ 浓度」：普通 Taq 缓冲液 Na⁺ 约 50 mM，qPCR 引物 200–500 nM。
  3. 看总览表的 Tm 与警告列：正负链 Tm 相差 >5°C、3' 端自互补 ≥4 bp、发夹茎 ≥4 bp 都建议重新设计。
  4. 「参数明细」表核对 ΔH/ΔS、发夹 ΔG 与同聚物位置；点「复制结果」或「下载 TXT」带走。

常见问题

近邻法 Tm 和 Wallace 公式差在哪？该信哪个？
Wallace 规则（2(A+T)+4(G+C)）只数碱基组成，把每对 G·C 当成固定贡献，14 nt 以内误差就有 ±5°C；近邻法逐段累加二核苷酸栈的热力学参数，计入末端修正、盐浓度与寡核苷酸浓度，一般误差 ±2°C 左右。设计引物、报告方法学请以近邻法为准，Wallace 只当快速核对。
盐校正为什么改的是熵？
DNA 磷酸骨架间的静电排斥随阳离子浓度升高被屏蔽，双链更稳定。SantaLucia 的处理方式是给 ΔS 加一项 0.368·N·ln[Na⁺]（N 为链长），让它进入 Tm 的分母——比早年「Tm 直接 +16.6·log₁₀[Na⁺]」的加性修正更贴近热力学，也更接近实测。本工具用熵校正口径。
3' 端自互补和发夹怎么读？
3' 端自互补指以 3' 末端收尾的一段能与序列内另一窗口完全配对（两条引物分子间即可成种），≥4 bp 就有引物二聚体苗头，≥8 bp 基本必出二聚体；发夹是同一条链自身折回形成的茎环，茎 ≥4 bp 且环 3–8 nt 时聚合酶延伸效率会明显下降。两者都给出 25°C 栈和近似 ΔG，越负越稳。
为什么我的序列里字母 N、I、X 被剔除了？
本工具按纯 ACGT（U 记作 T）的近邻栈计算，简并码（N/R/Y…）和非核酸字母没有栈参数，硬算会悄悄改变结果，所以直接剔除并在警告里计数。简并引物请逐条展开成具体序列分别计算。
引物会上传吗？
不会。页面纯静态、无后端接口，序列、浓度参数只在浏览器本地参与计算，输入仅写进本浏览器的 localStorage，清空或换设备即消失。未公开的引物序列也可以放心算。

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