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PrimerCalc 引物 Tm 計算

近鄰法 Tm · 鹽/濃度校正 · 髮夾與二聚體自查

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輸入引物序列

每行一條引物；支援「名稱 序列」與 FASTA（> 頭行）；大小寫不敏感，U 按 T 處理，空格與行號自動忽略。

反應條件

Tm 按近鄰法 ΔS 鹽校正（0.368·N·ln[Na⁺]）與濃度項 R·ln(Ct/4) 計算；普通 PCR 緩衝液 Na⁺ 約 50 mM，qPCR 引物濃度常取 200–500 nM。

Tm 與結構總覽

參數明細

SantaLucia 1998 最近鄰參數表

棧參數取自 SantaLucia, J. (1998) PNAS 95:1460-1465 表 2（統一參數）；起始修正 A•T 末端 +2.3 kcal/mol / +4.1 cal/(mol·K)、G•C 末端 +0.1 / 0，非自互補雙鏈另加對稱性修正 −1.4 cal/(mol·K)。Tm = ΔH×1000 ÷ (ΔS′ + R·ln(Ct/x)) − 273.15，普通雙鏈取 Ct=2C、x=4，自互補取 Ct=C、x=1；ΔS′ = ΔS + 0.368·N·ln[Na⁺]。

這是什麼工具

PrimerCalc 是 PCR 引物／寡核苷酸的線上 Tm 計算器：主結果用最近鄰熱力學法（SantaLucia 1998 統一參數表），把每個二核苷酸棧的焓與熵逐段相加，再疊加末端起始修正、對稱性修正、鹽濃度熵校正和濃度項 R·ln(Ct/x)，得到解鏈溫度 Tm；同時給出 GC%、GC 鉗、Wallace／簡易經驗式對照，以及 3' 端自互補、髮夾、同聚物等結構自查與設計規則警告。功能對標 Thermo Fisher OligoAnalyzer 與 IDT OligoCalc 的核心指標，且支援一次貼上多條序列批量算。

所有計算都在你自己的瀏覽器裏完成：參數表隨頁面下載，沒有後端、不上傳任何序列。當前輸入存在瀏覽器本地，刷新還在；幾百條引物也是毫秒級算完。引物二聚體與髮夾的 ΔG 用棧參數求和近似（不含起始項），與 MARMIA 的局部穩定性指標同一口徑，適合橫向比較不同候選引物。

功能

怎麼用

  1. 把候選引物貼進輸入框：每行一條；想標名字就寫「F1 ATGG…」或用 FASTA 頭行。
  2. 按你的體系調「引物濃度」和「Na⁺ 濃度」：普通 Taq 緩衝液 Na⁺ 約 50 mM，qPCR 引物 200–500 nM。
  3. 看總覽表的 Tm 與警告列：正負鏈 Tm 相差 >5°C、3' 端自互補 ≥4 bp、髮夾莖 ≥4 bp 都建議重新設計。
  4. 「參數明細」表核對 ΔH/ΔS、髮夾 ΔG 與同聚物位置；點「複製結果」或「下載 TXT」帶走。

常見問題

近鄰法 Tm 和 Wallace 公式差在哪？該信哪個？
Wallace 規則（2(A+T)+4(G+C)）只數鹼基組成，把每對 G·C 當成固定貢獻，14 nt 以內誤差就有 ±5°C；近鄰法逐段累加二核苷酸棧的熱力學參數，計入末端修正、鹽濃度與寡核苷酸濃度，一般誤差 ±2°C 左右。設計引物、報告方法學請以近鄰法為準，Wallace 只當快速核對。
鹽校正為什麼改的是熵？
DNA 磷酸骨架間的靜電排斥隨陽離子濃度升高被屏蔽，雙鏈更穩定。SantaLucia 的處理方式是給 ΔS 加一項 0.368·N·ln[Na⁺]（N 為鏈長），讓它進入 Tm 的分母——比早年「Tm 直接 +16.6·log₁₀[Na⁺]」的加性修正更貼近熱力學，也更接近實測。本工具用熵校正口徑。
3' 端自互補和髮夾怎麼讀？
3' 端自互補指以 3' 末端收尾的一段能與序列內另一窗口完全配對（兩條引物分子間即可成種），≥4 bp 就有引物二聚體苗頭，≥8 bp 基本必出二聚體；髮夾是同一條鏈自身折回形成的莖環，莖 ≥4 bp 且環 3–8 nt 時聚合酶延伸效率會明顯下降。兩者都給出 25°C 的棧參數求和近似 ΔG，越負越穩。
為什麼我的序列裏字母 N、I、X 被剔除了？
本工具按純 ACGT（U 記作 T）的近鄰棧計算，簡併碼（N/R/Y…）和非核酸字母沒有棧參數，硬算會悄悄改變結果，所以直接剔除並在警告裏計數。簡併引物請逐條展開成具體序列分別計算。
引物會上傳嗎？
不會。頁面純靜態、無後端介面，序列、濃度參數只在瀏覽器本地參與計算，輸入僅寫進本瀏覽器的 localStorage，清空或換設備即消失。未公開的引物序列也可以放心算。

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